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 pUCm-T载体

  产品编号D2006
  产品包装: 20次
  产品价格: 246.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D2006 pUCm-T载体 20次 246.00元

      pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片段的重组克隆。
      很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3'端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片段的重组载体。

pUCm-T载体的主要信息如下:
Base pairs 2773
Lac Z promoter 142-171
M13/pUC Sequencing Primer 204-221
Lac Z 222-534
Multiple cloning region 233-376
M13/pUC Reverse Primer 378-395
Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region 972-1832
ColE1 origin of replication(rep) 1987-2606

      pUCm-T载体的图谱如图1:


图1. pUCm-T载体图谱示意图

      pUCm-T载体的多克隆位点的详细序列如下(请特别注意其中的Pst I不是单酶切位点):

  Lac Z
201 ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTTGC ATGCCTGCAG
TGTGTCCTTT GTCGATACTG GTACTAATGC GGTTCGAACG TACGGACGTC
Xba I Xho I BamH I Bgl II
251 GTCGACTCTA GACTCGAGGG ATCCAGATCT CCAGTCTT GA CCTGGTCTGC
CAGCTGAGAT CTGAGCTCCC TAGGTCTAGA GGTCAGA TCT GGACCAGACG
Pst I Not I Nco I EcoR V Cla I Nde I T7 promoter
301 AGGCGGCCGC CCATGGGATA TCATCGATCA
TATGTCGC CC   TATAGTGAGT
TCCGCCGGCG GGTACCCTAT AGTAGCTAGT
ATACAGCG GG   ATATCACTCA
Kpn I Sac I EcoR I
351 CGTATTACGG TACCGAGCTC GAATTCACTG GCCGTCGTTT TACAACGTCG
GCATAATGCC ATGGCTCGAG CTTAAGTGAC CGGCAGCAAA ATGTTGCAGC

      pUCm-T载体中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pUCm-T)包括:

Afl II Age I Apa I Asc I Avr II Bbs I Bbv II Bcl I
Blp I BsaA I BseR I Bsg I BsiC I BsiW I Bsm I BsmF I
Bsp120 I BspM II BsrG I BssH II Bst1107 I BstB I BstE II BstX I
Bsu36 I Dra III Eco47 III Eco72 I Esp I Fse I Hpa I Mlu I
Msc I Mun I Nae I NgoM I Nhe I Nru I Nsi I PflM I
Pme I Pml I PpuM I PspA I Rsr II Sac II Sfi I Sma I
SnaB I Spe I Spl I Srf I Stu I Xca I Xma I

      pUCm-T载体中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pUCm-T once)包括:

HinD III A`AGCT,T 234 Acc65 I G`GTAC,C 360
BspM I ACCTGC 10/14 239 Asp718 G`GTAC,C 360
Sph I G,CATG`C 244 Kpn I G,GTAC`C 364
Sal I G`TCGA,C 252 Ban II G,RGCY`C 370
Acc I GT`MK,AC 253 Sac I G,AGCT`C 370
HinC II GTY|RAC 254 Apo I R`AATT,Y 372
Hind II GTY|RAC 254 EcoR I G`AATT,C 372
Xba I T`CTAG,A 258 Kas I G`GCGC,C 533
Ava I C`YCGR,G 264 Nar I GG`CG,CC 534
PaeR7 I C`TCGA,G 264 Ehe I GGC|GCC 535
Xho I C`TCGA,G 264 Bbe I G,GCGC`C 537
BamH I G`GATC,C 270 EcoO109 I RG`GNC,CY 780
BsaB I GATNN|NNATC 275 Aat II G,ACGT`C 841
Bgl II A`GATC,T 276 Ssp I AAT|ATT 955
Xcm I CCANNNN,N`NNNNTGG 289 Xmn I GAANN|NNTTC 1160
Tth111 I GACN`N,NGTC 293 Bsp1286 I G,DGCH`C 1177
Not I GC`GGCC,GC 305 Sca I AGT|ACT 1279
Eag I C`GGCC,G 305 EcoN I CCTNN`N,NNAGG 1399
Xma III C`GGCC,G 305 Cfr10 I R`CCGG,Y 1675
Dsa I C`CRYG,G 312 Bsa I GGTCTC 7/11 1694
Nco I C`CATG,G 312 Ahd I GACNN,N`NNGTC 1760
Sty I C`CWWG,G 312 AlwN I CAG,NNN`CTG 2239
EcoR V GAT|ATC 320 Afl III A`CRYG,T 2648
Cla I AT`CG,AT 325 Sap I GCTCTTC 8/11 2765

      pUCm-T载体的全序列信息: D2006 pUCm-T vector-seq.txt
      pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成,除多克隆位点外,其余序列同pUC19(GenBank Accession Number
M77789)。
      少量自连的载体转化得到的克隆由于编码了LacZ基因,而在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。大部分重组的载体,由于插入片段破坏了LacZ基因,因而在IPTG/X-Gal平板上转化得到白色克隆。这样就可以通过蓝白斑非常容易地筛选出重组克隆,蓝白斑筛选结果示意图如图2。

      图2. pUCm-T载体的蓝白斑筛选结果示意图。pUCm-T载体和PCR产物片段进行连接,转化后在IPTG/X-Gal平板的上长出的克隆,其中白色克隆代表PCR产物片段可能插入到pUCm-T载体中,但后续还需要酶切、PCR或者测序确认。

      对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的两个PstI酶切位点进行PstI单酶切鉴定,也可以使用廉价且高效的EcoRI、
BamHI、XbaI、HindIII等内切酶进行双酶切鉴定。
      构建完成的质粒可以通过质粒上的正反两个M13引物位点进行测序或通过T7 promoter上的T7引物位点进行测序。
      构建完成的质粒可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录,用于探针标记等。
      一个包装的本载体共可以进行20次连接反应。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D2006 pUCm-T载体 20μl
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项:
      本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
      DNA聚合酶是否可以在PCR产物3'端加A需参考该DNA聚合酶的说明。对于PCR产物为平端的情况,不适合用于T载体的连接反应。对于平端的PCR产物可以先进行在3'端加A的反应,再用T载体进行克隆。
      进行PCR产物克隆时需自备连接、转化等相关试剂、试剂盒。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. PCR产物纯化:
a. PCR产物可以通过PCR纯化试剂盒或凝胶回收试剂盒(例如碧云天生产的D0033 PCR纯化试剂盒D0056 DNA凝胶回收试剂盒)进行PCR产物纯化。对于PCR产物条带不是非常单一的情况,宜采用电泳后DNA凝胶回收的纯化方法,这样可以去除PCR扩增出来的非特异性条带的干扰。
2. 连接反应:
a. 对于常规的DNA ligase连接反应,请参考下面的连接反应体系,或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1微升pUCm-T载体,约0.2pmol PCR产物,在20微升连接体系中16℃连接过夜。

Sterilized Water ?μl
T4 DNA Ligase Buffer (10X) 2μl
Purified PCR Product ??μl
pUCm-T Vector 1μl
T4 DNA Ligase (5-10U/μl) 1μl
总体积 20μl

b. 对于快速连接试剂盒,请参考相应说明书进行连接反应。pUCm-T 载体的用量还是为1微升,PCR产物的推荐用量约为
0.2pmol。实际做连接反应时对PCR产物的使用量没有必要严格定量,根据PCR产物的亮度大致加入适量的PCR产物进行连接反应即可获得比较理想的连接效果。连接反应中使用的水尽量使用Milli-Q级纯水,或使用双蒸水或三蒸水。
3. 转化和筛选阳性克隆:
按照常规方法进行转化和蓝白斑筛选。转化可以采用碧云天生产的D0302 超级感受态细菌制备试剂盒。蓝白斑筛选所需的IPTG(ST098)和X-Gal(ST912)可以向碧云天购买。对于白斑可以进行酶切鉴定,通常酶切鉴定正确后可以进行测序鉴定。

相关产品:

产品编号 产品名称 包装
D2006 pUCm-T载体 20次
D0033 PCR/DNA纯化试剂盒 50次
D0056 DNA凝胶回收试剂盒 50次
D0302 超级感受态细菌制备试 剂盒 100次
ST097 IPTG 1g
ST098 IPTG 5g
ST912 X-Gal 100mg
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使用本产品的文献:
1. Hu J, Chai Y, Wang Y, Kheir MM, Li H, Yuan Z, Wan H, Xing D, Lei F, Du L.
PI3K p55γ promoter activity enhancement is involved in the anti-apoptotic effect of berberineagainst cerebral ischemia-reperfusion.
Eur J Pharmacol. 2012 Jan 15;674(2-3):132-42.
2. Zhou H, Chen S, Wang W, Wang Z, Wu X, Zhang Z.
Nanog inhibits lipopolysaccharide-induced expression of pro-inflammatory cytokines byblocking NF-κBtranscriptional activity in rat primary microglial cells.
Mol Med Rep. 2012 Mar;5(3):842-6.
3.X. Guo, S. Li, B. Du, Z. Li, W. Yang, W. Dong, J. Liu, Z. Zheng.
Neurogenin3 regulates sohlh during spermatognesis in mice.
The Journal of Animal & Plant Sciences. 2015;25(5):1303-10.