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 质粒中量抽提试剂盒

  产品编号D0018
  产品包装: 50次
  产品价格: 231.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D0018 质粒中量抽提试剂盒 50次 231.00元

      碧云天的质粒中量抽提试剂盒(Plasmid Midi Preparation Kit, Plasmid Midiprep Kit)是一种用于从大肠杆菌中进行中量质粒快速抽提的离心柱式试剂盒。
      本试剂盒适用于常用的EndA-菌株DH5A、JM109和XL-1 blue等。对于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101
等,可以顺利完成质粒抽提,但从EndA+菌株中抽提获得的质粒会有轻微的核酸酶污染,如果在内切酶缓冲液中37℃孵育1小时会导致质粒全部降解。从EndA+菌株中抽提质粒时推荐使用碧云天的D0007S/D0007M 质粒小量抽提试剂盒(通用型)、D0020 质粒中量抽提试剂盒(通用型)D0028 质粒大量抽提试剂盒(通用型)
      野生型大肠杆菌中表达Endonuclease I,能切割并降解双链DNA。编码Endonuclease I的基因是endA,如果endA突变失活,其基因型会被标注为endA1,相应的突变菌株被称为EndA-菌株,而野生型菌株则被称为EndA+菌株。常见的EndA-和EndA+菌株参见附表1。从EndA+菌株中抽提的质粒,微量核酸酶和质粒结合而容易被共纯化,导致容易降解。
      本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下,使质粒能在离心过柱的瞬间,结合到质粒纯化柱上,在一定条件下又能将质粒充分洗脱,从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提,无需酒精沉淀,12个样品只需不足60分钟即可完成。
      无需高速冷冻离心机,只需普通台式高速离心机。所有操作均可在1.5ml离心管中完成。
      每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限约为50微克。每个纯化柱可用于抽提5-10毫升用LB培养过夜的大肠杆菌。抽提所得质粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD260和OD280比值也会因菌种不同等原因而略有波动。
      本试剂盒抽提得到的质粒可直接用于转染细胞,DNA测序,PCR,基于PCR的突变,体外转录,转化细菌,内切酶消化等。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D0018-1 溶液I (悬浮液) 45ml
D0018-2 溶液II (裂解液) 45ml
D0018-3 溶液III (结合液) 60ml
D0018-4 溶液IV (洗涤液) 18ml (第一次使用前加入27ml无水乙醇)
D0018-5 溶液V (洗脱液) 8ml
D0018-6 RNase A (100mg/ml) 45μl
D0018-7 中抽质粒纯化柱及废液收集管 50套
说明书 1份

保存条件:
      室温保存,一年有效。
注意事项:
      第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液I (悬浮液)中,混匀,并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。
      第一次使用前在溶液IV (洗涤液)中加入27ml无水乙醇,混匀,并在瓶上做好标记。
      温度较低时,溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀,37℃水浴加热溶解,混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀,否则会产生大量气泡。
      溶液II使用完后,一定要盖紧瓶盖,防止被空气中二氧化碳酸化。
      溶液II有强碱性,溶液II和溶液III对人体有刺激性,操作时请小心,并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
      本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
      废液收集管在一次抽提中需多次使用,切勿中途丢弃。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 取过夜菌至3个1.5毫升离心管中,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清。再重复一次,每管共收集3毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟,如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密,不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清,再倒入约1.5毫升菌液并重复上述操作,然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸),使液体流尽。如果细菌密度明显偏低,可考虑使用更多菌液,再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过5毫升,对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过10毫升。过量的菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入250微升溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。
确认溶液I中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更长时间,悬起沉淀。一定要充分混匀,对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液,无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex,可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。
3. 每管加入250微升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次,使细菌完全裂解,溶液透明。
切勿vortex!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后,溶液应变得透明,无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开,那么颠倒4-6次后,可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况,可以增加颠倒次数3-5次,再室温放置2-3分钟,但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入350微升溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀,可见白色絮状物产生。
切勿vortex!颠倒次数也不宜过多,否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5. 最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。
离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱,废液收集管,并在纯化柱上做好标记。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒,倒弃收集管内液体。再重复两次,使三管质粒结合于同一纯化柱上。
质粒倒入质粒纯化柱后,可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。
7. 在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV,最高速离心30-60秒,洗去杂质,倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。
8. 再最高速离心1分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于洁净1.5毫升离心管上,加入120微升溶液V至管内柱面上,放置1分钟。
溶液V需要直接加至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液 V沾在管壁上,一定要震动离心管,使液体滑落到管底,以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q级纯水替代溶液V,但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长,对于增加质粒产量会略有帮助。
10. 最高速离心1分钟,所得液体即为高纯度质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒,可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。
附表1. EndA- and EndA+ strains of E. coli.

EndA- EndA+
BJ5183 BL21(DE3)
DH1 CJ236
DH20 HB101
DH21 JM83
DH5α JM101
JM103 JM110
JM105 LE392
JM106 MC1061
JM107 NM522 (all NM series are EndA+)
JM108 NM554
JM109 P2392
MM294 PR700 (all PR series are EndA+)
SK1590 Q358
SK1592 RR1
SK2267 TB1
SRB TG1
TOP10 Y1088 (all Y10 series are EndA+)
XL1-Blue BMH 71-18
XLO ES1301

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产品编号 产品名称 包装
D0003 质粒小量抽提试剂盒 200次
D0005 质粒小量抽提试剂盒 50次
D0007S 质粒小量抽提试剂盒(通用型) 50次
D0007M 质粒小量抽提试剂盒(通用型) 200次
D0018 质粒中量抽提试剂盒 50次
D0020 质粒中量抽提试剂盒(通用型) 50次
D0026 质粒大量抽提试剂盒 20次
D0028 质粒大量抽提试剂盒(通用型) 20次


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使用本产品的文献:
1. Jing RR, Cui M, Sun BL, Yu J, Wang HM.
Tissue-specific expression profiling of receptor for advanced glycation end products and itssoluble forms in esophageal and lung cancer.
Genet Test Mol Biomarkers. 2010 Jun;14(3):355-61.
2. Yongjin J. Zhou, Fan Yang, Sufang Zhang, Haidong Tan and Zongbao K. Zhao.
Efficient gene disruption in Saccharomyces cerevisiae using marker cassettes with long homologous arms prepared by the restriction-free cloning strategy.
World Journal of Microbiology and Biotechnology. . 2011 Dec;27(12):2999-3003.
3. Zhou Y, Wang L, Yang F, Lin X, Zhang S, Zhao ZK.
Determining the extremes of the cellular NAD(H) level by using an Escherichia coliNAD(+)-auxotrophic mutant.
Appl Environ Microbiol. 2011 Sep;77(17):6133-40.
4. Lu C, Tong F, Tang X, Zeng X, Liu D.
Poly(L-lysine)-based cylindrical copolypeptide brushes as potential drug and gene carriers.
J Control Release. 2015 Sep 10;213:e24-5.