使用说明：
1. 引物设计：
    用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
    (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
    (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
    (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)≥45。但引物也不宜过长，
        否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两
        侧按照上述计算得到的数值相近。
        例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则
        左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
        右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45
    (4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40%-60%。
    (5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体
        可以通过一些软件进行分析。
    (6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制：
    如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200
    微升水，配制成浓度为100μM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升100μM引
    物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因
    定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择：
    选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果
    GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因
    GC含量最好也在40-55%的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因
    GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出
    来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，
    或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
    必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常
    用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应：
    (1) 如下设置基因定点突变反应体系：

    按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入
    的Nuclease-Free Water的量，使总体积为49微升。适当混匀后，加入1ul Pfu DNA Polymerase，混
    匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
    (2) 按照如下参数设置PCR仪：

    说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。
5. Dpn I消化：
    PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪
    上进行，也可以在水浴锅中进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定：
    感受态细菌的转化效率必需至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽
    量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过
    Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的
    办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到50个
    以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。
    对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小
    与预期结果是否相符。
    取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2
    个克隆中会得到一个预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一
    个预期的突变克隆。

常见问题：
1. 转化后没有克隆或克隆数极少：
  (1) 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107以上，当然高一些更
      好。
  (2) 把Dpn I消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀，然后溶解在较小的体积中。这样就可以把
      所有的产物全部用于转化。
  (3) 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时
      间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃
      或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
  (4) 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
  (5) 如果使用矿物油(mineral oil)，在转化时如果把矿物油带入感受态菌，会严重影响转化效率。
2. 有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
  (1) Dpn I消化效果不佳。一种可能是加入Dpn I后，由于该酶在甘油中，会迅速下沉，如果没有混匀
      就会严重影响Dpn I的消化作用。另一种可能是Dpn I由于保存不当或保存时间过长等原因导致活
      性下降，这时可以适当延长消化的时间至1.5-2小时。
  (2) 使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I消化时不完全。我们这里推荐的模板质粒用量0.5微
      克，已经是模板质粒用量的上限，不能再使用更多的模板质粒了。
  (3) 尽量避免多次反复冻融dNTP。可以把dNTP适当分装后再使用。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
  (1) 引物设计不佳，并且PCR反应中退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
  (2) 引物质量较差，没有经过PAGE纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引
      物，容易导致非预期的突变。

     基因突变