产品简介:
BeyoRT M-MuLV反转录酶(BeyoRT M-MuLV Reverse Transcriptase)是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶。和普通的M-MuLV反转录酶相同,BeyoRT M-MuLV反转录酶也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶,可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成;同时具有Ribonuclease H(RNase H)酶活性,可以选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA,但不剪切单链RNA或双链RNA。
特点:BeyoRT M-MuLV反转录酶可以合成长达13kb的cDNA,而普通的M-MuLV反转录酶仅能合成长达9kb的cDNA;BeyoRT M-MuLV反转录酶的最适反应温度为42℃并且在50℃时仍然有很高活性,可以避免普通的M-MuLV反转录酶在37℃反应时的一些不足。
用途:BeyoRT M-MuLV反转录酶常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。BeyoRT M-MuLV反转录酶合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。BeyoRT M-MuLV反转录酶也可以用于DNA探针的标记,以及通过引物延伸(primer extention)来分析RNA。
来源:本BeyoRT M-MuLV反转录酶由大肠杆菌表达,表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片断。
活性定义:One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37°C. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP, 0.4 mM polyA·oligo(dT)12-18。
纯度:不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶,不含BeyoRT M-MuLV反转录酶本身含有的RNase H酶活力以外的RNA酶,满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
酶储存溶液:50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
Reaction Buffer(5X):250 mM Tris, pH 8.3 at 25°C, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT。
失活或抑制:70℃孵育10分钟可以导致BeyoRT M-MuLV反转录酶失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT M-MuLV反转录酶有抑制作用。
本产品用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。
包装清单:
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
D7153-1 |
BeyoRT M-MuLV反转录酶(200U/μl) |
2000U |
D7153-2 |
Reaction Buffer(5X) |
0.2ml |
- |
说明书 |
1份 |
保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
对于GC含量比较高的RNA的反转录,试剂盒的使用说明中给予了特别说明,请予以关注。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明:
1. cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesi):
a. 参考如下表格设置反转录反应:
模板(后面3种任选一种) |
Total RNA |
0.1-5μg |
或Poly(A) RNA/mRNA |
10-500ng |
或Specific RNA |
0.01pg-500ng |
引物(后面3种任选一种) |
Oligo(dT)18 |
0.5μg (或100pmol) |
random hexamer |
0.2μg (或100pmol) |
Gene specific primer |
15-25pmol |
DEPC-treated Water |
- |
To 13.7μl* |
Reaction Buffer (5X) |
- |
4μl |
RNase Inhibitor |
- |
0.5μl** |
dNTP Mix (25 mM each) |
- |
0.8μl *** |
BeyoRT M-MuLV反转录酶 |
- |
1μl |
总体积 |
|
20μl |
*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。注意:对于GC含量比较高的
RNA模板的反转录反应, 加入DEPC-treated Water混匀后微离心,接着可以在65°C孵育5分
钟,随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
**RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量,例如0.5μl或其他适当体积。在加入其
他体积时,DEPC-treated Water的用量需适当调整。
***dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整,此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
b. 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀),随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物,在42°C孵育60分钟。如果使用
random hexamer(随机六聚体)作为引物,先在25°C孵育10分钟,随后在42°C孵育60分钟。注
意:对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应,可以设置为45°C孵育60分钟。
d. 70°C孵育10分钟以失活BeyoRT M-MuLV反转录酶并终止反转录反应。说明:对于长片断的cDNA不
推荐采用加热的方法失活BeyoRT M-MuLV反转录酶,这种操作可能会导致部分长片断DNA被剪切。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应,也可以-20°C冻存以备以后使用。用于后续PCR反应
时,如果PCR的反应体系为50微升,则推荐使用2微升反转录产物。
2. 其他用途请请自行参考M-MuLV反转录酶的相关文献资料进行。
常见问题:
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,
因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩
增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有
可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物
质量欠佳。