使用说明：
1. 准备工作：
   A. 取出TdT Buffer(5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。
   B. 取出待标记的DNA 探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。
2. DNA探针的标记：
   A. 如下设置反应体系：

   B. 用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。
   C. 加入2.5μl探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3. TdT的去除：
   A. 探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说
      明：静止后有机相和水相会很快分层)。
   B. 12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的DNA探针。
4. 探针的纯化(选做)：
   通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结
   果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
   A. 对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混
      匀。
   B. -70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。
   C. 4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
   D. 4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
   E. 加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。
5. 生物素标记探针标记效率的检测：
   A. 取5μl Biotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control
      Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、
      0.5nM和0.25nM。
   B. 取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀释成10nM生物素标
      记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、
      0.5nM和0.25nM。
   C. 参考下面的表格，取一适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜)或带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标
      记。对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2μl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样
      品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明：如果条件许可，可
      以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针用量也参考下表，浓度
      可以稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100μl。

   D. 滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。
   E. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联30-45秒。如果没
      有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪，产品编号EUV002)，
      距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射
      1-10分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
   F. 随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天
      直至进行后续检测。
   G. 如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比样品和标准品的灰度，从而计
      算出探针的标记效率。例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol标准品的灰度相同，则说明探
      针的标记效率大致为50%，待测样品中总探针的浓度约为1μM，而实际被生物素标记的探针约为0.5
      μM。探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。用于后续检测时通常要求标
      记效率不低于30%。有文献报道标记效率和3'末端的碱基无关，但和整个待标记探针的序列有
      关。由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3'端加上多个Biotin标记的dUTP，因此有时会出现
      标记效率大于100%的情况。

     DNA标记和检测