Caspase 3 活性检测试剂盒/Caspase 3 Activity Assay Kit

产品简介

产品简介：
    Caspase 3 活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。
    Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)，ICAD(Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin和fodrin等。这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩(chromatin condensention)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。同时caspase 3对细胞起泡(Cell blebbing)也起到关键作用。
    本Caspase 3 活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
    试剂盒中提供了caspase 3催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 3酶活性的标准品。
    本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测100个样品。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C1116-1	裂解液	30ml
C1116-2	检测缓冲液	10ml/瓶，共2瓶
C1116-3	Ac-DEVD-pNA(2mM)	200μl/管，共5管
C1116-4	pNA(10mM)	1ml
—	说明书	1份

保存条件：
    -20℃保存，Ac-DEVD-pNA和pNA需避光保存。
注意事项：
    须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405，如有困难可以测定A400。
    Ac-YVAD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
    测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)，可向碧云天订购。建议样品用水稀释1倍后再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。
    pNA(中文名为4-硝基苯胺)有毒，请注意小心防护。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明：
1.准备工作：
  A.裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
  B.检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2.测定pNA标准曲线：
  A.标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
  B.把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
  C.每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测，
    测定A405。
  D.每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出
    pNA浓度相当于A405的标准曲线。
3.样品的收集：
  A.对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小
    心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加
    入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3D。
  B.对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。
    600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前
    吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分
    钟。下转步骤3D。
  C.对于组织样品：按照每3-10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器
    匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。
  D.4℃ 16,000-20,000g离心10-15分钟。
  E.把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
  F.立即测定caspase 3的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，
    尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10微升待测样品中含有10-30μg蛋白。如果细胞较小，可以
    适当增加细胞的用量。
4.caspase 3酶活性的检测：
  A.取出pNA和适量的Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用。
  B.如下设置反应体系：

	空白对照	样品
检测缓冲液	90μl	80μl
待测样品	0μl	10μl
Ac-DEVD-pNA(2mM)	10μl	10μl
总体积	100μl	100μl

    注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气
    泡。随后再加入10μl Ac-DEVD-pNA(2mM)。
  C.加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化
    比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
  D.样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1
    中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
  E.参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will
    cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37℃ under
    saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃可以剪切
    1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力
    单位的caspase 3。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和
    的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 3酶活力特别
    高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
  F.用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行
    蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。

常见问题：
1.测定出的A405过低：
  A.样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近1-3mg/ml。
  B.样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该
    caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强
    的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16
    和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具
    体情况而定。
  C.通过上述优化后A405还是比较低，或浓缩样品或做时间曲线比较困难，可以在测定样品时加大样品
    的用量，最多可达40μl。
    假设每次测定样品的用量为xμl，则：
    C1.此时标准品稀释液需按如下方法配制：按照xμl裂解液加入检测缓冲液至最终体积为100μl的
    比例配制适量的标准品稀释液。例如样品用量为40μl，则按照40μl裂解液加入60μl检测缓冲
    液，即0.4ml裂解液加入0.6ml检测缓冲液的比例配制标准品稀释液。其余标准曲线的测定方法
    同上面的使用说明所述。
    C2.此时如下设置反应体系：

	空白对照	样品
检测缓冲液	90μl	(90-x)μl
待测样品	0μl	xμl
Ac-DEVD-pNA(2mM)	10μl	10μl
总体积	100μl	100μl

说明：其中x不超过40，其余检测方法同上面的使用说明所述。

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