一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒

 产品编号: C1086
 产品包装: 20次
 产品价格: 1280.00元
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产品简介

产品简介:
    碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织,只要经过一步染色反应,洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。
    细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP),从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。注:FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写,实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。
    本试剂盒有如下优点。(1)高灵敏度:可以在单细胞水平检测到细胞凋亡,同时由于凋亡早期就有DNA断裂,可以检测到早期的细胞凋亡。(2)特异性:TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞,而不容易标记坏死细胞。(3)快速:仅需约1-2个小时即可完成。(4)方便:只需一步染色反应,洗涤后即可观察,不必使用二抗等进行多步操作。(5)应用范围广:可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
    TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂,但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开,另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
    极少数细胞凋亡时没有DNA断裂,此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下,最好同时检测多个凋亡指标。
    本试剂盒足够检测20个样品。
包装清单:

产品编号

产品名称

包装

C1086-1

TdT酶

40μl

C1086-2

荧光标记液

960μl

C1086-3

TdT酶稀释液(选用)

500μl

说明书

1份

保存条件:
    -20℃保存,荧光标记液需避光保存。
注意事项:
    需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS,用于封片的抗荧光淬灭封片液(P0126),用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天订购免疫染色固定液(P0098),同时需自备含0.1% Triton X-100的PBS或向碧云天订购免疫染色洗涤液(P0106)
    如果用于石蜡切片的检测,需自备蛋白酶K,二甲苯。蛋白酶K(ST533)可以向碧云天订购。
    为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明:
1. 对于贴壁细胞或细胞涂片:
   a. PBS或HBSS洗涤一次。
   b. 如果细胞贴得不牢,可以干燥样品使细胞贴得更牢。
   c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
   d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
   e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106),冰浴孵育2分钟。
   f. 转步骤5。
2. 对于悬浮细胞或细胞悬液:
   a. 收集细胞(不超过200万细胞),PBS或HBSS洗涤一次。
   b. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成
      团,宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
   c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
   d. 用含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)重悬细胞,冰浴孵育2分
      钟。
   e. 转步骤5。
3. 对于石蜡切片:
   a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。
      70%乙醇2分钟,蒸馏水2分钟。
   b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K,20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自
      行摸索)。
   c. PBS或HBSS洗涤3次。注意:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。
   d. 转步骤5。
4. 对于冷冻切片:
   a. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
   b. PBS或HBSS洗涤2次,每次10分钟。
   c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106),冰浴孵育2分钟。
   d. 转步骤5。
5. 配制TUNEL检测液:
    参考下表配制适当量的TUNEL检测液,需充分混匀。注意:配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕,不能冻存。

 

1个样品

5个样品

10个样品

TdT酶

2μl

10μl

20μl

荧光标记液

48μl

240μl

480μl

TUNE检测液

50μl

250μl

500μl

6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片:
   a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
   b. 在样品上加50μl TUNEL检测液,37℃避光孵育60分钟。注意:孵育时需注意在周围用浸足水的纸
      或药棉等保持湿润,以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。
   c. PBS或HBSS洗涤3次。
   d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm,发射波长
      范围为515-565nm(绿色荧光)。
7. 对于悬浮细胞或细胞悬液:
   a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
   b. 加入50μl TUNEL检测液,37℃避光孵育60分钟。
   c. PBS或HBSS洗涤2次。
   d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。
   e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为
      450-500nm,发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

常见问题:
1. 出现非特异性荧光标记。
   a. 有些细胞或组织,例如平滑肌细胞或组织,nuclease或polymerase的酶活性水平较高,易导致出
      现非特异性的荧光标记。解决方法是,取细胞或组织后立即固定并且要充分固定,以阻止这些酶
      导致假阳性。
   b. 使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液,导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。
   c. TUNEL检测反应时间过长,或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润,
      也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间,并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。
2. 荧光背景很高。
   a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。支原体染色检测试剂盒
      (C0296)
可以向碧云天订购。
   b. 高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
   c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后
      的TdT酶需当日使用。
   d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
3. 标记效率低。
   a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
   b. 固定时间过长,导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。
   c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。
   d. 碘化丙啶双染时,如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙
      啶可以接受fluorescein激发产生的荧光,从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶
      染色,例如0.5微克/毫升碘化丙啶。


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