Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒/Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

产品简介

产品简介：
    Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。
    Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。但仅Annexin V被报道可以调控一些PKC的活性。
    Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。
    用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
    本试剂盒还提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现红色荧光。
    综上所述，参考下图，用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(下图左下角)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈阴性(下图右下角)；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(下图右上角)。下图左上角出现的是许可范围内的检测误差。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C1062-1	Annexin V-FITC	100μl
C1062-2	Annexin V-FITC结合液(4X)	3ml
C1062-3	碘化丙啶染色液	220μl
—	说明书	1份

保存条件：
    4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，半年有效。为长期保存，可以把Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液适当分装后-20℃保存，Annexin V-FITC结合液可以直接-20℃保存。
注意事项：
    如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
    染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
    荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
    需自备PBS。另外，使用前Annexin V-FITC结合液(4X)必须稀释成1X。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明：
准备工作：取适量Annexin V-FITC结合液(4X)，用MilliQ级纯水或双蒸水稀释至1X。例如1ml Annexin V-FITC结合液(4X)中加入3ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即为Annexin V-FITC结合液(1X)。Annexin V-FITC结合液(1X)如果有多余可以-20℃保存，以备下次使用。
1.对于悬浮细胞：
  A.在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm)离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重
    悬细胞并计数。注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证
    后续Annexin V-FITC的结合。
  B.取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬
    细胞。
  C.加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
  D.室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。
  E.1000g离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。
  F.加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
  G.随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检
    测，1000g离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞，涂片后，
    荧光显微镜下观察。
2.对于贴壁细胞：
  A.把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化
    细胞。
  B.细胞消化下来后，加入步骤2A中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，
    弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。。
  C.取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬
    细胞。
  D.加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
  E.室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。
  F.1000g离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。
  G.加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
  H.随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检
    测，1000g离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞，涂片后，
    荧光显微镜下观察。
3.对于贴壁细胞的原位荧光显微镜检测：
  注：本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。
  A.(选做)如果条件许可，把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内。在凋亡诱导结束后，用可以对多
    孔板进行离心的离心机1000g离心5分钟。
  B.吸除细胞培养液，加入PBS洗涤一次。(如果条件许可，在吸除PBS前1000g离心5分钟。)
  C.加入195μl Annexin V-FITC结合液(1X)。
  D.加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
  E.室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。
  F.吸除溶液，加入190μl Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。(如果条件许可，在吸除溶液前
    1000g离心5分钟。)
  G.加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
  H.随即在荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

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